PCR技艺用于进化分析的磋议 　　进化遗传学具有两个比肩的磋议标的：系统发育的重建和种群分析。自1962年， Zuckerkandl和Pauling冷落卵白质序列和基因序列的相比不错象分子种一样用于记号 现有物种分化的时分以来，多样生化顺次被用于系统发育的磋议。在最先二十年内， 同功酶的电泳分析、免疫学相比和卵白质序列分析被平淡地应用。而最近，DNA-DNA 杂交和核糖体RNA序列分析为分类学作念出了蹙迫孝敬。这些技艺大多有局限性，因为 它们是想到而不是径直测量序列的辞别。 　　那些把珍见识会聚在同功酶的分析及细胞核和细胞器DNAs撤废图谱分析上的种群 生物不需要具有更高分辩率的顺次。直到如今，要取得比几个典型生物更多的序列数 据齐是不执行的。在筛选克隆文库、制作克隆子的图谱及测序上所需的尽力过大，以 至对特定物种进行更多的个体检测是不可能的。团员酶链瓜在克服了用于进化磋议的 传统DNA分析法的局限性。 通用引物 　　初看，对序列了解得不够好象撤废了PCR的应用，因为对序列的某些了解是筹办 PCR引物所必需的。幸好，有一种取得新物种引物序列的快速顺次。通过采取平淡保 留在不同物种中的序列，可筹办出通用引物，用于扩增一个特定细胞核或细胞器的基 因片断，此基因片断可取自一个较大类群的绝大多数成员，如：植物或真菌。这就把 系统发育的序列相比分析范围彭胀到了纲或门的分类水平上。而且此法对飘零标本和 诀别生物类型在种群中的位置起蹙迫作用。基于这些主张，线粒体DNA（mtDNA）序列 较适用。底下，咱们胪陈对于细胞核及线粒体序列均适用的通用引物。线粒体基因法 是一个精准的检测顺次；因为mtDNA进化相配快，筹办此分子的引物会发生贫瘠。 核基因引物 　　撏〝引物的见地在多数的_°?_RNAs径直测序中已使用多年。那些交流的引物极易 配对，通过PCR扩增核糖体DNA序列。rDNA扩增具有几个进步rRNA径直测的优点。首 先白虎 做爱，DNA可当作肇端物资白虎 做爱，而用从组织中制备DNA比制备RNA容易。第二，样品用量更 少。终末，用多样测序酶及技艺进行的DNA测序可用来从两链上取得数据并绕过核糖 体RNAs复杂的二极结构对其进行测序。 　　举例，咱们设讦的引物可扩增好多真菌、原天真物、藻类、植物及动物的 18SrDNA上约515bp的片断（扩增区加引物约为555bp）。引物NS1和NS2的筹办依据为 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)、Dictyosteliumdiscoideum和 Stylonichiapustulata 18S rDNA 中的保守核苷酸序列，这在其它场所也有胪陈。 　　NS15'-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3'　　 NS25'-GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3' 　　NSl和NS2在本章讲述的实验条目下不扩增细菌或线粒体rRNA基因。NS1和NS2扩增 片断的序列互异（对某些生物是长度的互异）有助于对分子分化进行初步想到，即在 有多样生物的当然群中决定不同的物种数目。这些引物也可用于检测在索要自动物或 植物组织的原始DNA中是否有真菌DNA的沾污。Medlin偏激助手胪陈了可扩增低等真核 生物完整的18s基因的其它引物，这些引物对于此类生物的系统发育磋议比NS1和NS2 更有效。 线粒体DNA引物 　　对线粒体基因序列的磋议适于处理好多在进化及种群生物学中的问题。因线粒体 在脊椎动物中进行无性繁衍遗传，它是重建母性系统发育的理念念模子。其高速度的点 突变进化使它成为在种间进行高分辩率的种群磋议的典型，其在物种中突变的赶快固 定也使其分子成为物种飘零的理念念依据，尤其是对微型生物而言。 　　因脊椎动物mtDNA进化速度相配快（约为核基因的10倍），寻找保守序列当作PCR 的驱动位点会很贫瘠。图1所示为扩增细胞色素b基因上一个370bp区段（扩增片断为 376bp）的两个引物的位置。经检测，细胞色素b存在于大多数脊椎动物（哺乳类、鸟 类、爬行类、两栖类和鱼类）。引物Ll4841和Hl5149在已发表的核苷酸序列的保守区 上。字母L和H默示mtDNA的轻链与重链，数字默示引物3'碱基在已发表的东谈主类完整 mtDNA序列上的位置。 　　图1在脊椎动物线粒体基因组的共有结构中细胞色素b的保守引物位置。此分子编 码13种卵白质、22种tRNA。调控区也叫D-环，在细胞色素b及12srRNA基因之间。Koche 等胪陈了mtDNA上其它的保守引物区。 　　Ll48415'-AAAAAGCTTCCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3' 　　Hl51495'-AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATATTTGTCCTCA-3' 　　咱们使用截短了的这些引物也得胜地扩增了哺乳动物、鸟类及两栖类的DNA。引 物MVZ3和MVZ4的序列如上图划线部分，可扩增311bp区段（扩段片断366bp）。 　　细胞色素b基因上的序列含有高分辨率的系统发育信息何况在生物类群中存在范 围极广。因卵白质结构及作用保存得十分完整，序列定位容易进行，亲缘连系近的可 通过因密码子中不行径位点的弯曲而发生的变化来想到，亲缘连系远的则可通过分析 颠换互异或替代氨基酸来检测。 顺次 DNA制备 　　自消化过的组织中索要DNA，组织在100mMTrispH8.0，10mMEDTA，100mMNaCl， 0.1%SDS，50mMDTT，0.5μg/ml卵白酶K缓冲液中37℃消化几小时。DNA用酚抽提两 次，用酚/氯仿（1:1）提纯一次，再用氯仿提纯一次，纯化的样品经离心透析或酒精 千里淀进行浓缩。 DNA扩增及测序 　　扩增在100μl反馈液中进行，反馈液含有67mMTrispH8.8，6.7mMMgSO4，16mM硫 酸铵，10mMβ巯基酒精，四种dDNP各1mM，两种引物各1μM，10-100ng基因组DNA，及 2.5单元TaqDNA团员酶（PerkinElmer/Cetus）。团员酶链反馈的每个轮回包括93℃变 性1分钟，50℃退火1分钟及72℃链蔓延2-5分钟。此轮回重叠25-40次，具体次数依 DNA模板的肇端浓度而定。取5μl扩增搀和物在2%琼脂糖凝胶（NuSieve，FMCCorp.） 上电泳，电泳缓冲液为40mMTris-乙酸（H8.0），用溴化乙啶染色。 　　将含有扩增居品的胶带切下，溶于1ml蒸馏水，用1μl此溶液当作第二次链反馈 的模板，制备用于测序的单链DNA。在第二次反馈中，两种引物中的一个浓度减少100 倍。经40个扩增轮回后，经2-4次重叠离心透析撤退游离核苷酸及盐。DNA用商品试剂 盒进行测序，用第二次链反馈中被减少的阿谁作引物。 技艺珍摄事项 　　通过普及些有机体DNA的退火温度，可纠正扩增居品的特异性及产量。在一个引 物比例为50:1的35个轮回的单链PCR反馈中，加多后的特异性可使单链DNA模板径直由 肇端模板产生。纠正后的反馈所用dDNP浓度缩短（每种为32μM），轮回参数为：在 93℃肇端变性3分钟，然后进行35个轮回，即93℃变性25秒，55℃退火25秒，55℃退 火25秒，72℃链蔓延2分钟。在线状期加多72℃链蔓延时分可加多用于测序的单链模 板的产量。上述轮回参数与引物NSl及NS2联用扩增真菌DNA可撤退在图2第1谈中所出 现的过剩条带。 　　对于好多不同个体或生物中交流基因的扩增及测序磋议，必须严格地幸免在DNA 分离及制备扩增居品时出现交叉沾污。在配制PCR反馈液时，只可使用带行径枪头及 活塞的吸量器。用一扩增DNA的吸量器决弗成再用于组织DNA的分离或在另一轮扩增前 稀释DNA。不含DNA而含有所有这个词其它试剂及稀释剂等的对照要包括在每次实验中，以检 测沾污。在极点环境下，需要更换引物用以扩增靶基因上的一个不同的序列并用新吸 量器来进行DNA分离或配制PCR反馈液。 恶果 　　图2透露了用从多样生物中索要的5ng总DNA及引物NS1和NS2扩增rDNA的一个片断 的恶果。约560bp的主要DNA扩增居品可从所有这个词的被测生物样品中看到，但其在长度上 有一些小辞别。因这些引物适用范围平淡，它们可用于共生笔物的检测。举例，一朝 取得一组菌根真菌和其宿主植物的序列数据，就可用种特异性DNA探针来检测及飘零 在当然种群中的单个共生对。 　　mtDNA引物用于扩增多种生物的细胞色素b区段。图3透露了五种脊椎动物的细胞 色素bmtDNA序列定位。这些序列即透露了引物的通用性又透露了其定位的同线性。尽 管有显蓍的序列错配，引物仍可用于东谈主类、鼠和牛mtDNA的扩增（图4）。 　　图2用NS1和NS2作引物的核小亚基rRNA基因片断的扩增恶果。除退火温度为45℃ 外，扩增反馈条目、电泳及溴化乙啶染色不雅察顺次见《实验顺次》一节中所述。 1.Laccariabicolor一种菌根担子菌，2.Alderglutinosa，3.果蝇（Drosophilamel anogaster）4.Anelosimusexinius，一种蜘蛛，5.Tyromycesunicolor，一种担子菌 rDNA重叠单元的克隆质粒DNA。6.不含DNA的阴性对照7.空格8.法式分子量参照物（P hiX174RFHaeⅢ） 　　TGLFLAMHYSPDASTAFSSIAHITR25 　　HumanACAGGACTATTCCTAGCCATGCACTACTCACCAGACGCCTCAACCGCCTTTTCATCA ATCGCCCACATCACTCGA75 　　sheepACAGGCCTATTCCTAGCAATACACTATACACCTGACACAACAACAGCATTCTCCTCT GTAACCCACATTTGCCGA75 　　ChickenACCGGCCTAGTACTAGCCATGCACTACACAGCAGACACATCCCTAGCCTTCTCCT CCGTAGCCCACACTTGCCGG75 　　saiamanderACAGGGTTATTTTTAGCTATACATTATACAGCAGATACATCATCAGCATTCT CATCCGTAGCCCACATTTGCCGA75 　　FishACAGGCCTTTTCCTAGCCATACACTATACCTCCGACATCGCCACCGCCTTTTCCTCCG TCGCCCACATCTGTCGT75 　　DVNYGWIIRYLHANGASMFFICLFL50 　　HumanGACGTAAATTATGGCTGAATCATCCGCTACCTTCACGCCAATGGCGCCTCAATATT CTTTATCTGCCTCTTCCTA150 　　SheepGACGTAAACTATGGCTGAATTATCCGATAAATACACGCAAACGGGGCATCAATATT TTTTATCTGCCTATTTATG150 　　ChickenAACGTACAATACGGCTGACTCATCCGGAATCTCCACGCAAACGGCGCCTCATTC TTCTTCATCTGTATCTTCCTT150 　　SalamanderGATGTAAATTATGGTTGACTTATACGAAATATTCACGCAAACGGCGCTTCA TTCTTTTTTATTATTATCTTTCTT150 　　FishGACGACGTCAACTACGGTTGACTCATCCGAAATATGCACGCCAACGGCGCATCCTTC CTCTTCATTTGTATTTAC150 　　HIGRGLYYGSFLYSETWNIGIILLL75 　　HumanCACATCGGGCGAGGCCTATATTACGGATCATTTCTCTACTCAGAAACCTGAAACA TCGGGATTATCCTCCTGCTT225 　　SheepCATGTAGGACGAGGCCTATACTATGGATCATATACGTTCCTAGAAACATGAAACAT TGGAGTAATCCTCCTATTC225 　　ChickenCACATCGGACGAGGCCTATACTACGGCTCATATATGTTCAAAGAAACATGAAAC ATTGGAGTAATTTTATTATTT225 　　SalamanderCATATTGGTCGAGGAATATATTACGGCTCATATATGTTCAAAGAAACATGA AACATTGGAGTAATTTTATTATTT225 　　FishCACATTGGCCGAGGGTTATACTATGGCTCCTATTTATATAAAGAAACCTGAAATATT GGAGTTATCCTCCTCCTT225 　　图3五种脊椎动物的细胞色素b的部分序列。如《实验顺次》一节所述用引物 L14841和Hl5149的扩增。氨基酸序列是东谈主类mt 　　DNA的翻译居品。其它序列分别是羊（绵羊，Ovisaries）、鸡（原鸡， Gullusgullus）、蝾螈（Ambystomatigrinum）和丽鱼（Julidochromisregani）的。 用错配引物进行的扩增 　　PRIMER 　　Fish5'-CCATCCAACATCTCAGCATGATGAAA-3' 　　TEMPLATE 　　Human..................c.............. 　　Cow...........A.........T.....T..... 　　Mouse............T.......T.......... 　　图4.用错配引物进行的扩增。透露细胞色素b引物Ll4841的部分序列。尽管在引 物中部有几处错配，但它能用来扩增多样哺乳动物的模板。3'终局与模板配对完整是十足蹙迫的。 磋议 　　从任何一种生物的几个DNA分子上赶快扩增序列的技艺在进化及生态学磋议中有 多种用途。在此咱们磋议此技艺发展的长进偏激在这些鸿沟中的其它应用。 分子分类学 　　诚然用核酸序列数据进行分类磋议的优点早已被承认，但序列相比数据的蕴蓄过 程齐是繁琐的。PCR/？通用引物技艺所提供的快速测序法促使分子分类学的范围彭胀 到更多的类群。由序列中得出的均一数据为多样类群的生物提供了一个共同的系统发 育框图。序列数据通常也提供了昔时的顺次所弗成提供的分辨率。线粒体DNA的扩增 和径直测序也已用地取得序列来证果真对于东谈主类的mtDNA家系图中非洲东谈主是其基础。 在另一项磋议中，对灵长类型组织相容性基因的系统发育分析标明HLA-DQα基因座的 好多等位基因的发源早于东谈主类的发生。 　　因为只需要有靶序列几个分子扩增就不错完成，好多以前很难进行分子分析的样 品齐不错使用。不错用博物馆保存的及植物标本室中的标本进应用命促进了分子数据 在多样分类磋议中的应用。这些技艺在古代标本上的应用亦然令东谈主欣忭的。在佛罗里 达泥炭沼中保存了7000年的脑DNA中发现其含有一个在现有土蓍好意思洲东谈主中不存在的新 型mtDNA。 种群生物学 　　序列的快速扩增使在DNA序列水平上进行多数的种群磋议成为可能。单链扩增对 几十或十百个个体进行快速测序而不历程以前所需的繁琐的克隆要领。一朝得到了一 组具代表性的序列数据，可用更便捷而简便的分析顺次，如用等位基因寡聚核苷酸探 针（见16章）来取得等位基因的序列数据。 　　对博物馆标本进行测序的使命使对过期的基因序列的磋议变得更容易了。Thomas 及助手通过保存标本的皮肤mtDNA扩增磋议了70年内的一系列啮齿动物类群。直于今 日用当代分子技艺分析在如斯长的一段时分基因序列的变异才成为可能。 生态及海洋生物学 　　对分析来说，传统分子技艺所需的组织样品用量相对较多。尤其是好多无脊椎动 物，它们对于进行分子检测所用的一般操作顺次来讲太小。因此，对于小生物、共生 生物或那些在培养基中不易滋长的生物个体的径直分析是贫瘠。团员酶链反馈有和来 扩大能进行分子检测的生物范围。目下不错径直磋议象原生物和藻类等单细胞生物自 然种群的基因结构。此顺次在生物的散布及数目分析中会有平淡的应用，尤其是用于 海洋环境中的生物。终末，团员酶链反馈的明锐性使其不错检出及飘零少许的单细胞 生物、共生生物及寄生生物，既使样品是来后来二者宿主的DNA搀和物中也可检出。 无损害样品覆按 　　用于基因分析的样品一般齐需要采血样或取组织。这就撤废了基因分析在行动学 及生态学磋议中的应用，在这些鸿沟中必须把对象所受的过问减到最低。从诸如单根 头发等法医学样品中扩增序列为行动科学家及保留生物学家提供了一个新契机。无损 伤样品覆按也使网罗用于磋议的危急生物的样品变得容易。 分子磋议和生物体磋议的协同 　　通过分子分析所开发的物种磋议新鸿沟，咱们但愿在分子生物学家及种群生物学 家之间建筑多数的相互合营。举例为系统发育的重建所网罗的相比序列可明晰地透露 出卵白质的结构及作用。频繁不在实验室里进行的，对顺应独有环境的生物体的分子 磋议可能会揭示独物的分子顺应性变化。相背，对遗传变异体的分子结构的了解也有 助于咱们了解生物体是何如进化的。哔哩哔哩官网在线观看

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